Уламжлалт үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний гол ялгаа нь уламжлалт ПГУ нь ДНХ-ийн тодорхой дарааллыг олшруулах зорилгоор боловсруулсан арга бөгөөд үүрлэсэн ПГУ нь хоёр дараалсан олшруулах урвалаас бүрдэх уламжлалт ПГУ-ын өөрчлөлт юм. -цаг хугацааны ПГУ нь олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээг тодорхойлох боломжтой ердийн ПГУ-ын хувилбар юм.
ПГУ нь ДНХ илрүүлэхэд судалгаа, анагаах ухаанд өргөн хэрэглэгддэг шинжлэх ухааны маш түгээмэл арга юм. ПГУ-ын шинжилгээг ДНХ эсвэл РНХ илрүүлэх замаар эсрэгтөрөгчийг илрүүлэхэд ашигладаг. Ерөнхийдөө вирусын РНХ нь эсрэгбие илрүүлэх эсвэл өвчний шинж тэмдгийг харуулахаас өмнө биед байдаг. ПГУ-ын шинжилгээ нь хэн нэгэнд вирус байгаа эсэхийг эрт илрүүлж чадна. Одоогоор ПГУ нь COVID-19 өвчнийг илрүүлэх стандарт шинжилгээ юм. Бодит цагийн ПГУ, үүрлэсэн ПГУ, мультиплекс ПГУ, халуун эхлэх ПГУ, урт хугацааны ПГУ гэх мэт өөр өөр төрлийн ПГУ-ын аргууд байдаг.
Ердийн ПГУ-ын шинжилгээ гэж юу вэ?
Уламжлалт ПГУ-ын шинжилгээ нь молекул биологийн лабораторид тогтмол хийдэг in vitro ДНХ олшруулах арга юм. Энэ арга нь тодорхой ДНХ-ийн фрагментийг хэдэн мянгаас хэдэн сая хувь болгох боломжийг олгосон. Кари Муллис энэ аргыг 1980 онд нэвтрүүлсэн. Энэ техникийг олон хуулбарлахын тулд загвар гэж нэрлэгддэг ДНХ-ийн хэлтэрхий шаардлагатай. Так полимераз нь ДНХ полимеразын ферментийн үүрэг гүйцэтгэдэг бөгөөд загвар дарааллын шинэ хэлхээний нийлэгжилтийг хурдасгадаг.
ПГУ-ын хольц дахь праймерууд нь фрагментийн өргөтгөлийн эхлэлийн цэг болж ажиллана. ДНХ-ийн хуулбар хийхэд шаардлагатай бүх бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ПГУ-ын холимогт оруулсан болно. ПГУ-ын урвал нь ПГУ-ын машинд явагддаг бөгөөд үүнийг зөв ПГУ-ын холимог, зөв ПГУ-ын програмаар тэжээх ёстой. Хэрэв урвалын холимог болон програм зөв байвал маш бага хэмжээний ДНХ-ээс ДНХ-ийн тодорхой хэсгийн шаардлагатай тооны хуулбарыг гаргана.
Зураг 01: Уламжлалт ПГУ-ын шинжилгээ
ПГУ-ын урвалд гурван үндсэн үе шат байдаг: денатураци, праймерыг нөхөх, хэлхээ сунгах. Эдгээр гурван үе шат нь гурван өөр температурт явагддаг. ПГУ-ын буфер нь Так полимеразын үйл ажиллагааны оновчтой нөхцлийг бүрдүүлдэг. ПГУ-ын урвалын эдгээр гурван үе шат нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг шаардлагатай хэмжээгээр үйлдвэрлэхийн тулд давтагдана. ПГУ-ын урвал бүрт ДНХ-ийн хуулбарын тоо хоёр дахин нэмэгддэг. Тиймээс ПГУ-д экспоненциал олшруулалтыг ажиглаж болно. ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг гель дээр харагдахуйц хэмжээний ДНХ үүсгэдэг тул гель электрофорез ашиглан шийдвэрлэх боломжтой бөгөөд дараалал тогтоох зэрэг цаашдын судалгаанд зориулж цэвэршүүлэх боломжтой.
ПГУ нь анагаах ухаан, биологийн судалгааны үнэ цэнэтэй хэрэгсэл юм. Ялангуяа шүүх эмнэлгийн судалгаанд ПГУ нь гэмт хэрэгтнүүдийн жижиг дээжээс судалгаа хийх ДНХ-г олшруулж, шүүх эмнэлгийн ДНХ-ийн профайлыг гаргаж чаддаг тул асар их ач холбогдолтой юм. ПГУ-ыг генотип, ген клончлох, мутаци илрүүлэх, ДНХ-ийн дараалал тогтоох, ДНХ-ийн бичил массив, эцэг тогтоох шинжилгээ зэрэг молекул биологийн олон салбарт өргөнөөр ашигладаг.
Nested ПГУ-ын шинжилгээ гэж юу вэ?
Nested PCR нь ДНХ-ийн өвөрмөц бус олшролтыг бууруулдаг ПГУ-ын нэг төрөл юм. ПГУ-ын шинжилгээнд дараалсан хоёр ПГУ эсвэл хоёр дараалсан олшруулах урвал байдаг. Эхний олшруулалтын урвалын үед ПГУ-ын бүтээгдэхүүн үүсдэг. Эхний урвалын дараа эхний урвалын ПГУ-ын бүтээгдэхүүн дээр хоёр дахь олшруулах урвал явагдана. Тиймээс хоёр дахь урвалын хольц дахь праймерууд нь ПГУ-ын эхний бүтээгдэхүүнтэй холбогдож, түүнийг өсгөдөг.
Зураг 02: Дотоод ПГУ
Праймерын хос урвал бүрт өөр өөр байдаг. Праймеруудын өвөрмөц бус холболт нь үүрлэсэн ПГУ-д багасдаг. Өвөрмөц ПГУ-ын шинжилгээ нь мэдрэмж ба/эсвэл өвөрмөц байдлыг нэмэгдүүлэхэд тустай. Гэсэн хэдий ч үүрлэсэн ПГУ-д сонирхсон дарааллын талаар мэдлэг шаардлагатай.
Бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээ гэж юу вэ?
Бодит цагийн ПГУ буюу тоон ПГУ (Q PCR) нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг тоон байдлаар хэмждэг ПГУ-ын өөрчлөгдсөн хувилбар юм. Тиймээс энэ техник нь бодит цагийн ПГУ-ын машин ашиглан олшруулалтыг бодит цаг хугацаанд нь тодорхойлдог. Энэ нь дээжинд байгаа зорилтот дараалал эсвэл генийн хэмжээг тодорхойлоход тохиромжтой арга юм.
Бодит цагийн ПГУ-ын сонирхолтой онцлог нь олшруулалт болон бодит тоон үзүүлэлтийг хоёуланг нь нэг алхам болгон нэгтгэдэгт оршино. Тиймээс илрүүлэхийн тулд гель электрофорез хийх хэрэгцээг бодит цагийн ПГУ-ын аргаар арилгаж болно. ПГУ-ын урвалын явцад ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг шошголохын тулд флюресцент будагч бодис ашиглах нь эцсийн дүндээ шууд тоон үзүүлэлтийг гаргахад хүргэнэ. ПГУ-ын бүтээгдэхүүн хуримтлагдах үед флюресцент дохионууд хуримтлагддаг бөгөөд тэдгээрийг бодит цагийн машинаар хэмжих болно. SYBR Green болон Taqman нь бодит цагийн ПГУ-ын олшруулах процессыг илрүүлэх эсвэл үзэх хоёр арга юм. Энэ хоёр арга нь олшруулах процессын явцыг хянаж, бүтээгдэхүүний хэмжээг бодит цаг хугацаанд мэдээлдэг.
Зураг 03: Бодит цагийн ПГУ
Бодит цагийн ПГУ нь генийн илэрхийлэлийн хэмжигдэхүүн, микроРНХ ба кодчилдоггүй РНХ-ийн шинжилгээ, SNP генотип, хуулбарын дугаарын хувилбаруудыг илрүүлэх, ховор мутац илрүүлэх, генийн өөрчлөлттэй организмыг илрүүлэх зэрэг олон төрлийн хэрэглээтэй. халдвар үүсгэгчийг илрүүлэх.
Ердийн үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний хооронд ямар төстэй зүйл байдаг вэ?
- Нэст болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээ нь ердийн ПГУ-ын шинжилгээний өөрчлөлт юм.
- Гурван техник нь ДНХ-ийн дээжийг олшруулдаг.
- Тэдгээрийн бүтээгдэхүүнийг дэс дараалал эсвэл шинжилгээнд ашиглаж болно.
- Эдгээр шинжилгээнд праймер шаардлагатай.
Ердийн үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний хооронд ямар ялгаа байдаг вэ?
Уламжлалт ПГУ нь ДНХ-ийн тодорхой дарааллыг олшруулах зорилгоор боловсруулсан арга юм. Үүний зэрэгцээ, Nested PCR нь хоёр дараалсан олшруулах урвалаас бүрдэх уламжлалт ПГУ-ын өөрчлөлт бөгөөд бодит цагийн ПГУ нь олшруулсан бүтээгдэхүүний хэмжээг тодорхойлох боломжтой ердийн ПГУ-ын хувилбар юм. Тиймээс энэ нь ердийн үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний гол ялгаа юм. Ердийн болон бодит цагийн ПГУ-аас ялгаатай нь үүрлэсэн ПГУ нь хоёр праймер багцыг ашигладаг. Түүнчлэн, өвөрмөц бус олшруулагчийг багасгахын тулд үүрлэсэн ПГУ-д хоёр дараалсан өсгөлтийн урвал байдаг. Үүнээс гадна ердийн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээнд хоёр дараалсан олшруулах урвал байдаггүй.
Дараах инфографик нь ердийн үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний ялгааг зэрэгцүүлэн харьцуулах зорилгоор хүснэгт хэлбэрээр жагсаасан болно.
Хураангуй – Уламжлалт ба үүрлэсэн ба бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээ
Уламжлалт ПГУ нь ДНХ-ийн тодорхой хэсгүүдийг олшруулахад зориулагдсан анхны арга юм. Nested ПГУ болон бодит цагийн ПГУ нь ердийн ПГУ-ын хоёр хувилбар юм. Хоёр дараалсан олшруулах урвал ба үүрлэсэн ПГУ-д хоёр праймер багцыг ашигладаг. Бодит цагийн ПГУ-ыг олшруулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээг тодорхойлох зорилгоор боловсруулсан. Тиймээс энэ нь ердийн үүрлэсэн болон бодит цагийн ПГУ-ын шинжилгээний ялгааг нэгтгэн харуулав.
