Гол ялгаа – Сангер дараалал ба Пиросеквенци
ДНХ-ийн дараалал нь ДНХ-ийн шинжилгээнд маш чухал бөгөөд учир нь тодорхой ДНХ-ийн бүс дэх нуклеотидын зөв байршлын талаарх мэдлэг нь түүний талаарх олон чухал мэдээллийг олж харуулдаг. ДНХ-ийн дараалал тогтоох янз бүрийн аргууд байдаг. Sanger sequencing болон Pyrosequencing нь молекул биологид өргөн хэрэглэгддэг ДНХ-ийн дараалал тогтоох хоёр өөр арга юм. Sanger sequencing болон Pyrosequencing хоёрын гол ялгаа нь Sanger sequencing нь нуклеотидын дарааллыг уншихын тулд ДНХ-ийн нийлэгжилтийг зогсоохын тулд дидеоксинуклеотидыг ашигладаг бол пиросатын дараалал нь нуклеотидуудыг нэгтгэж, нэмэлт дарааллын дарааллыг уншихын тулд пирофосфатын ялгаралтыг илрүүлдэгт оршино.
Sanger Sequencing гэж юу вэ?
Сэнжерийн дараалал нь 1977 онд Фредерик Сэнгер болон түүний коллежийн боловсруулсан ДНХ-ийн дараалал тогтоох анхны үеийн арга юм. Дидеоксинуклеотид (ddNTPs)-ээр гинж дуусгавар болгоход суурилдаг тул үүнийг Chain Termination Sequencing буюу Дидеокси дараалал гэж нэрлэдэг. Энэ аргыг Шинэ үеийн дараалал (NGS) боловсруулах хүртэл 30 гаруй жилийн турш өргөн хэрэглэгдэж байсан. Сэнгерийн дарааллын техник нь нуклеотидын зөв дарааллыг олж илрүүлэх эсвэл тодорхой ДНХ-ийн фрагментийг холбох боломжийг олгосон. Энэ нь in vitro ДНХ-ийн хуулбарлах явцад ddNTP-ийг сонгон нэгтгэх, ДНХ-ийн синтезийг зогсооход суурилдаг. Зэргэлдээх нуклеотидын хооронд фосфодиэфирийн холбоо үүсэхийг үргэлжлүүлэх 3' OH бүлэг байхгүй байгаа нь ddNTP-ийн өвөрмөц онцлог юм. Иймээс ddNTP бэхлэгдсэний дараа гинжин суналт зогсч, тэр цэгээс дуусна. Sanger дараалалд ашигладаг ddATP, ddCTP, ddGTP болон ddTTP гэсэн дөрвөн ddNTP байдаг. Эдгээр нуклеотидууд нь ДНХ-ийн өсөн нэмэгдэж буй хэлхээнд нэгдэх үед ДНХ-ийн хуулбарлах процессыг зогсоож, янз бүрийн урттай богино ДНХ үүсгэдэг. Капилляр гель электрофорез нь эдгээр богино ДНХ хэлхээг 01-р зурагт үзүүлсний дагуу гель дээр хэмжээгээр нь зохион байгуулахад ашиглагддаг.
Зураг 1: Синтезжүүлсэн богино ДНХ-ийн капилляр гель электрофорез
ДНХ-ийг in vitro хуулбарлахад цөөн хэдэн шаардлагыг хангасан байх ёстой. Эдгээр нь ДНХ полимеразын фермент, загвар ДНХ, олигонуклеотидын праймер, дезоксинуклеотид (dNTPs) юм. Sanger дараалалд ДНХ-ийн хуулбарыг дөрвөн төрлийн ddNTP-ийн хамт дөрвөн тусдаа туршилтын хоолойд хийдэг. Дезоксинуклеотидууд нь холбогдох ddNTP-ээр бүрэн солигддоггүй. Тодорхой dNTP-ийн холимог (жишээлбэл, dATP + ddATP) хоолойд багтаж, хуулбарлана. Дөрвөн тусдаа хоолойн бүтээгдэхүүнийг дөрвөн тусдаа худагт гель дээр ажиллуулдаг. Дараа нь гель уншсанаар 02-р зурагт үзүүлсэн шиг дарааллыг байгуулж болно.
Зураг 02: Сангерийн дараалал
Сэнгерийн дараалал нь молекул биологийн олон салбарт тусалдаг чухал арга юм. Хүний геномын төсөл Сангерийн дараалалд суурилсан аргуудын тусламжтайгаар амжилттай хэрэгжсэн. Сэнгерийн дараалал нь зорилтот ДНХ-ийн дараалал тогтоох, хорт хавдар, удамшлын өвчний судалгаа, генийн экспрессийн шинжилгээ, хүний таних, эмгэг төрүүлэгчийг илрүүлэх, бичил биетний дараалал тогтоох зэрэгт ашигтай.
Sanger дараалалд хэд хэдэн сул тал бий:
- Дараалсан ДНХ-ийн урт нь 1000 үндсэн хосоос урт байж болохгүй
- Нэг удаад зөвхөн нэг хэлхээг дараалуулж болно.
- Үйл явц нь цаг хугацаа их шаарддаг бөгөөд үнэтэй.
Тиймээс эдгээр асуудлуудыг даван туулахын тулд цаг хугацааны явцад шинэ дэвшилтэт дарааллын техникийг боловсруулсан. Гэсэн хэдий ч Сангерийн дараалал нь ойролцоогоор 850 хүртэлх үндсэн хосын уртын фрагментийн өндөр нарийвчлалтай үр дүнгийн улмаас ашиглагдаж байна.
Pyrosequencing гэж юу вэ?
Pyrosequencing нь "синтезээр дараалал тогтоох" дээр суурилсан ДНХ-ийн дараалал тогтоох шинэ техник юм. Энэ техник нь нуклеотидын нэгдлийн үед пирофосфатын ялгаралтыг илрүүлэхэд суурилдаг. Уг процессыг ДНХ полимер, ATP сульфурилаза, люцифераза ба апираз болон аденозин 5' фосфосульфат (APS) ба люциферин гэсэн хоёр субстрат гэсэн дөрвөн өөр фермент ашигладаг.
Уг процесс нь нэг судалтай ДНХ загвартай праймерыг холбож, ДНХ полимераз нь түүнд нэмэлт нуклеотидуудыг нэгтгэж эхэлдэг. Нуклеотидууд хоорондоо нэгдэх үед (нуклейн хүчлийн полимержилт) пирофосфат (хоёр фосфатын бүлэг хоорондоо холбогдсон) бүлэг, энерги ялгардаг. Нуклеотидын нэмэлт бүрд ижил моляр хэмжээний пирофосфат ялгардаг. Пирофосфат нь субстрат APS-ийн дэргэд ATP сульфурилазын нөлөөгөөр ATP болж хувирдаг. Үүсгэсэн ATP нь люциферазын зуучлалын нөлөөгөөр люцифериныг оксилуциферин болгон хувиргаж, ATP-ийн хэмжээтэй пропорциональ хэмжээгээр харагдах гэрлийг үүсгэдэг. Гэрлийг фотон илрүүлэх төхөөрөмж эсвэл фото үржүүлэгчээр илрүүлж, пирограмм үүсгэдэг. Апираза нь урвалын хольц дахь ATP болон нэгдээгүй dNTP-ийг задалдаг. dNTP нэмэх нь нэг удаа хийгддэг. Нуклеотидын нэмэлт нь гэрлийн нэгдэл, илрүүлэлтийн дагуу мэдэгдэж байгаа тул загварын дарааллыг тодорхойлж болно. Пирограммыг Зураг 03-т үзүүлсэн ДНХ-ийн дээжийн нуклеотидын дарааллыг бий болгоход ашигладаг.
Пиросеквенци нь нэг нуклеотидын полиморфизмын шинжилгээ болон ДНХ-ийн богино хугацааны дараалалд маш чухал юм. Өндөр нарийвчлал, уян хатан байдал, автоматжуулалтад хялбар, зэрэгцээ боловсруулалт зэрэг нь Сангерийн дарааллын техникээс пироз дарааллын давуу тал юм.
Зураг 03: Пиросеквенци
Sanger Sequencing болон Pyrosequencing хоёрын ялгаа нь юу вэ?
Сэнжер дараалал ба Пиросеквенци |
|
| Сэнгерийн дараалал нь ДНХ полимеразаар ddNTP-ийг сонгон нэгтгэж, гинжин хэлхээг таслахад үндэслэсэн ДНХ дараалал тогтоох арга юм. | Пиросеквенци нь нуклеотид нэгдэх үед пирофосфатын ялгаралтыг илрүүлэхэд суурилсан ДНХ-ийн дараалал тогтоох арга юм. |
| ddNTP ашиглах | |
| ddNTP нь ДНХ-ийн хуулбарыг зогсооход ашиглагддаг | ddNTP-г ашиглаагүй. |
| Оролцож буй ферментүүд | |
| ДНХ полимеразыг ашигладаг. | ДНХ полимераз, ATP сульфурилаза, Люцифераза, Апираза гэсэн дөрвөн ферментийг ашигладаг. |
| Ашигласан субстрат | |
| APS болон Люцифериныг ашигладаггүй. | Аденозин 5' фосфосульфат (APS) болон люцифериныг хэрэглэдэг. |
| Хамгийн их температур | |
| Энэ удаашралтай процесс. | Энэ бол хурдан процесс. |
Хураангуй – Сангер дараалал ба Пиросеквенци
Сэнгерийн дараалал ба Пиросеквенци нь молекул биологид хэрэглэгддэг ДНХ-ийн дараалал тогтоох хоёр арга юм. Сэнгерийн дараалал нь гинжин хэлхээний суналтыг зогсоох замаар нуклеотидын дарааллыг дарааллаар нь бүтээдэг бол пирос дараалал нь нуклеотидуудыг нэгтгэж, пирофосфатын ялгаралтыг илрүүлэх замаар нуклеотидын нарийн дарааллыг бий болгодог. Тиймээс Sanger дараалал ба Пиросеквенцийн гол ялгаа нь Sanger дараалал нь гинжин хэлхээний төгсгөлийн дараалал дээр ажилладаг бол пирос дараалал нь синтезээр дарааллаар ажилладагт оршино.
