Гол ялгаа – Максам Гилберт ба Сангерийн дараалал
Нуклеотидууд нь ДНХ-ийн үндсэн бүтцийн нэгж ба барилгын материал юм. ДНХ-ийн молекул нь полинуклеотидын гинжин хэлхээнээс тогтдог. ДНХ-д дөрвөн өөр нуклеотид байдаг. Эдгээр нуклеотидууд нь А (аденин), G (гуанин), С (цитозин), Т (тимин) гэсэн дөрвөн өөр азотын суурьтай. ДНХ-ийн молекул дахь нуклеотидын дараалал нь организмын өсөлт, хөгжилд чухал генетикийн мэдээллийг кодлодог тул маш чухал юм. ДНХ-ийн дараалал гэдэг нь ДНХ-ийн нуклеотидын нарийн дарааллыг тодорхойлох үйл явцыг хэлнэ. ДНХ-ийн дараалал тогтоох янз бүрийн аргууд байдаг. Максам Гилбертийн дараалал ба Сэнгерийн ДНХ-ийн дараалал нь эхний үеийн дараалалд хамаарах ДНХ-ийн дарааллын хоёр арга юм. Максам Гилбертийн дараалал тогтоох процедур нь дөрвөн нуклеотид тус бүр дээр 5' төгсгөлтэй ДНХ-ийн хэсгүүдийг химийн аргаар задлах, гель электрофорез хийх замаар үндсэн дарааллыг тодорхойлдог. Сэнгерийн дараалал тогтоох процедур нь ДНХ полимераз ба дидеоксинуклеотид, гель электрофорез ашиглан нэг судалтай ДНХ-ийг нэгтгэх замаар нуклеотидын дарааллыг тодорхойлдог. Энэ бол Maxam Gilbert болон Sanger Sequencing-ийн гол ялгаа юм.
Максам Гилберт дараалал гэж юу вэ?
Максам Гилбертийн дараалал тогтоох буюу химийн дараалал тогтоох арга нь ДНХ дахь нуклеотидын дарааллыг тодорхойлох зорилгоор боловсруулсан арга юм. Энэ аргыг 1976 онд Уолтер Гилберт, Алан Максам нар нэвтрүүлсэн бөгөөд цэвэршүүлсэн ДНХ-ээр шууд хийх боломжтой тул түгээмэл болсон. Максам Гилбертийн арга нь ДНХ-ийн дарааллын эхний үеийнх бөгөөд энэ нь эрдэмтдийн өргөн хэрэглэгддэг анхны дарааллын арга юм.
Энэ аргын үндсэн зарчим нь 01-р зурагт үзүүлсний дагуу эцсийн шошготой ДНХ-ийн фрагментуудыг тодорхой сууринд хамаарах химийн бодис, нөхцлөөр хязгаарлаж, шошготой хэсгүүдийг электрофорезээр салгахад оршино. гель дээрх хэмжээгээрээ. Хэсэг хэсгүүд нь шошготой байдаг тул ДНХ молекулын дарааллыг хялбархан гаргаж болно.
Максам Гилбертийн арга нь ДНХ-г тодорхой суурь дээр задлахад үндсэн тодорхой химийн бодис ашигладаг. Диметил сульфат болон гидразин хэмээх хоёр нийтлэг химийн бодисыг пурин болон пиримидиныг сонгон довтлоход ашигладаг.
Максам Гилберт дарааллын аргыг дараах байдлаар хэд хэдэн алхмаар гүйцэтгэдэг.
- Хязгаарлалтын эндонуклеаз ашиглан ДНХ-ийн дарааллыг цэвэршүүлэх
- Цацраг идэвхт фосфат нэмж ДНХ-ийн хэсгүүдийн төгсгөлийг шошголох
- Гель электрофорезын аргаар шошгогүй хэсгүүдээс шошготой хэсгүүдийг цэвэршүүлэх
- Төгсгөлийн шошготой ДНХ-г дөрвөн хоолойд салгаж, үндсэн химийн бодисоор тусад нь эмчлэх
- Гол тус бүрийн агуулгыг гель дээр тус тусад нь шугаман дээр электрофорез хийж, уртын дагуу хэсгүүдийг тусгаарлана.
- Авторрадиографаар хэлтэрхий илрүүлэх.
Зураг 01: Максам Гилбертийн дараалал
Sanger Sequencing гэж юу вэ?
Sanger Sequencing нь өгөгдсөн ДНХ-ийн фрагментийн үндсэн дарааллыг тодорхойлох зорилгоор 1977 онд Фредерик Сэнгер болон түүний хамтрагчид боловсруулсан дарааллын арга юм. Үүнийг мөн гинжин хэлхээний дараалал эсвэл Дидеокси дарааллын арга гэж нэрлэдэг. Энэ арга нь хэлхээ үүсэхийг зогсоохын тулд нэг хэлхээтэй ДНХ-ийн нийлэгжилтийн явцад ddGTP, ddCTP, ddATP, ddTTP зэрэг гинж төгсгөлийн дидеоксинуклеотидуудыг (ddNTPs) сонгон нэгтгэх зарчим дээр ажилладаг. Дидеоксинуклеотид нь зэргэлдээ нуклеотидтэй фосфодиэфирийн холбоо үүсгэхэд 3' OH бүлэггүй байдаг. Иймээс, ddNTP нь сангерын дарааллын үед шинээр үүссэн хэлхээнд орсны дараа утас үүсэх нь зогсдог.
Энэ аргын хувьд нэг төрлийн ddNTP бүхий дөрвөн тусдаа хоолойд дөрвөн тусдаа ДНХ синтезийн урвал (ПГУ) хийгддэг. ПГУ-ын хоолойд праймер, dNTPs, Taq полимераз, тодорхой нөхцөл гэх мэт бусад шаардлагыг хангасан болно. Дөрвөн холимог бүхий дөрвөн хоолойд дөрвөн тусдаа урвал явагдана. ПГУ-ын урвалын дараа үүссэн ДНХ-ийн хэсгүүд нь дулаанаар денатурат болж, гель электрофорезээр тусгаарлагддаг. Дараа нь 02-р зурагт үзүүлсэн шиг шошготой (цацраг идэвхт эсвэл флюресцент) праймер эсвэл dNTP ашиглан хэсгүүдийг дүрслэн харуулна.
Зураг 02: Сангерийн дараалал
Максам Гилберт болон Сэнгер дараалал хоёрын ялгаа юу вэ?
Максам Гилберт Сэнгерийн дараалал |
|
| Максам Гилбертийн дараалал нь ДНХ-ийн дараалал тогтооход зориулагдсан анхны техник юм. | Сэнжерийн дарааллын аргыг Максам Гилбертийн дарааллын аргын дараа нэвтрүүлсэн. |
| Хэрэглээ | |
| Энэ аргыг ховор хэрэглэдэг. | Сангерийн дарааллыг дараалалд тогтмол ашигладаг. |
| Химийн аюултай бодисын хэрэглээ | |
| Энэ нь химийн аюултай бодис ашигладаг. | Химийн аюултай бодисын хэрэглээ Максам Гилбертийн аргатай харьцуулахад хязгаарлагдмал. |
| Илрүүлэх шошго | |
| Энэ арга нь ДНХ-ийн хэсгүүдийн төгсгөлийг шошголоход цацраг идэвхт P32 ашигладаг. | Сангер дараалал нь цацраг идэвхт эсвэл флюресцентээр тэмдэглэгдсэн ddNTP-г ашигладаг. |
Хураангуй – Максам Гилберт Сэнгерийн дараалал
Максам Гилберт ба Сэнгерийн дараалал нь эхний үеийн ДНХ-ийн дараалалд хамаарах хоёр төрлийн ДНХ дарааллын техник юм. Максам Гилбертийн дараалал нь 1976 онд ДНХ-ийн дараалал тогтооход нэвтрүүлсэн анхны арга бөгөөд үндсэн дээр тодорхойлогдсон химийн бодисоор төгсгөлийн шошготой ДНХ-ийн фрагментуудыг задлах замаар гүйцэтгэдэг. Тиймээс үүнийг химийн дараалал гэж нэрлэдэг. Sanger дарааллын аргыг 1977 онд нэвтрүүлсэн бөгөөд ddNTP-д суурилсан гинжин хэлхээний төгсгөлийн урвал дээр суурилдаг. Сэнгерийн дарааллын арга нь Максам Гилбертийн аргын хэт их цаг зарцуулалт, химийн аюултай бодис ашиглах гэх мэт хэд хэдэн сул талуудаас шалтгаалан түгээмэл байдаг. Энэ бол Максам Гилберт болон Сэнгерийн дарааллын ялгаа юм.
