Гол ялгаа – Ген хувилах ба ПГУ
Тодорхой ДНХ-ийн фрагментаас олон тооны ДНХ-ийн нийлэгжилтийг ДНХ-ийн олшруулалт гэнэ. ДНХ-ийг олшруулах хоёр үндсэн процесс байдаг: ген клончлох ба ПГУ. Ген хувилах ба ПГУ-ын гол ялгаа нь ген хувилах нь рекомбинант ДНХ-ийг бүтээж, нянгийн дотор ургах замаар тодорхой генийн олон хуулбарыг in vivo үүсгэдэг бол ПГУ нь ДНХ-ийн тодорхой фрагментийн олон сая хуулбарыг in vitro-д давтан циклд оруулдаг. денатураци ба синтез.
Ген клон гэж юу вэ?
Генийн клонжуулалт нь рекомбинант ДНХ-ийг бүтээх замаар организмын гаргаж авсан геномын ДНХ-ээс тодорхой генийг олж, үржүүлэхэд ашигладаг арга юм. Геномын ДНХ нь уургийн кодлогдсон олон мянган генийг агуулдаг. ДНХ-г гаргаж авахдаа түүнд дааж чадах бүх генүүд багтана. Ген хуваах техник нь нийт ДНХ-ээс тодорхой генийг илрүүлэх боломжийг олгосон. Тиймээс ген клончлох нь молекул биологийн чухал хэрэгсэл болдог.
ДНХ-д холбогдох генийн байршлын талаар ямар ч мэдээлэл байхгүй бол генийн клончлолд организмын геномын номын санг бий болгох нь чухал юм. Геномын санг дараах алхмуудыг ашиглан хийдэг.
Алхам 1: Хүссэн генийг агуулсан организмаас нийт ДНХ-г гаргаж авах.
Алхам 2: Хандсан ДНХ-ийн задралыг хязгаарлаж, удирдах боломжтой жижиг хэсгүүдийг гаргана. Энэ алхамыг хязгаарлах эндонуклеазууд хөнгөвчилдөг.
Алхам 3: Тохирох векторыг сонгож, ижил хязгаарлах эндонуклеазуудыг ашиглан вектор ДНХ-ийг нээх. Бактерийн плазмидуудыг ихэвчлэн гадны ДНХ-ийг зөөвөрлөх вектор болгон ашигладаг. Плазмидууд нь бактерийн дотор байрлах ДНХ-ийн жижиг тойрог юм.
Алхам 4: Рекомбинант ДНХ молекул үүсгэхийн тулд вектор ДНХ болон хуваагдсан ДНХ-г нэгтгэх. Энэ алхмыг ДНХ лигаз удирддаг.
5-р алхам: ДНХ-ийн рекомбинант молекулуудыг эзэн бактери руу шилжүүлэх. Энэ алхмыг хувиргалт гэж нэрлэдэг бөгөөд дулааны цохилтыг ашиглан хийгддэг.
Алхам 5: Өсгөвөрлөгч дээр өөрчлөгдсөн бактерийн эсийг скрининг хийх. Хувиргах процессын төгсгөлд хувирсан болон хувираагүй хост эсийн холимог популяцийг олж авдаг. Сонирхолтой ген нь зөвхөн өөрчлөгдсөн хост эсийг агуулдаг. Тиймээс хувирсан эсүүдийг сонгох шаардлагатай. Сонголтыг антибиотик агуулсан сонгомол медиа ашиглан хийдэг. Энэ скрининг дээр зөвхөн хувирсан эсүүд ургаж, сонголт хийх боломжтой.
Алхам 6: Генийн сан үүсгэхийн тулд нян үржүүлэх. Энэ үе шатанд хувирсан хост эсийг шинэ өсгөвөрлөх орчинд нэвтрүүлж, өсөлтийн оновчтой шаардлагыг хангадаг. Соёлын хавтан дээрх нийт колони нь тухайн организмын геномын санг төлөөлдөг.
Алхам 7: Сонирхсон генийг агуулсан рекомбинант ДНХ молекулыг рекомбинант ДНХ-ийн мянга мянган хувилсан фрагментуудаас шалгана. Үүнийг тодорхой ген эсвэл тухайн генийн тодорхой уургийн үр дүнг тэмдэглэдэг датчик ашиглан хийж болно.
Нийт колониос бактерийн колони агуулсан сонирхож буй генийг тодорхойлсны дараа уг генийг агуулсан рекомбинант плазмидын сая сая хуулбарыг хийх боломжтой.
Генийн клончлолыг генийн сан байгуулах, тусгай уураг, витамин, антибиотик, гормон үйлдвэрлэх, организмын геномыг дараалал тогтоох, зураглах, шүүх эмнэлгийн шинжилгээнд хувь хүний ДНХ-ийн олон хуулбарыг гаргах гэх мэт үйл ажиллагаанд ашигладаг.
Зураг_1: Ген хувилах
ПГУ гэж юу вэ?
Полимеразын гинжин урвал (ПГУ) нь тодорхой ДНХ-ийн фрагментийн олон тооны хуулбарыг үүсгэдэг арга юм. Тодорхой ДНХ-ийн дарааллын экспоненциал олшруулалтыг in vitro нөхцөлд ПГУ-аар олж авдаг. Энэ техник нь ДНХ-ийн жижиг дээжийг ашиглах боломжтой хэмжээгээр үржүүлж чаддаг тул молекул биологийн маш хүчирхэг хэрэгсэл юм. ПГУ-ыг 1983 онд Кари Муллис танилцуулсан бөгөөд энэхүү шагналт бүтээл нь молекул биологийн салбарт асар том дэвшлийг бий болгосон.
ПГУ-ын техник нь Зураг 02-т үзүүлсэн ПГУ-ын давтан урвалын дараа явагддаг. Нэг ПГУ-ын урвал нь гурван өөр температурт явагдах гурван үндсэн үе шатаас бүрдэнэ; 94 0C-т ДНХ-д давхар хэлхээний денатураци, 68 0C температурт праймеруудын ангалзалт, 72 0-д сунах C. Тиймээс ПГУ-ыг хийхдээ зөв хуулбарлахын тулд температурын хэлбэлзлийг өндөр түвшинд байлгах хэрэгтэй. ПГУ-ыг ПГУ-ын хоолой доторх ПГУ-ын машинд хийдэг. ПГУ-ын хоолойд загвар ДНХ, Так полимераз, праймер, dNTP болон буфер агуулсан зөв ПГУ-ын хольцыг ачаална. Давхар хэлхээтэй дээжийн ДНХ-г нэг хэлхээтэй ДНХ болгон денатурацлах нь 94 – 98 0C температурт нэмэлт суурийн хоорондох устөрөгчийн холбоог таслах замаар хийгддэг. Дараа нь загвар ДНХ-ийн нэг хэлхээ нь праймеруудад илэрдэг. Хос праймер (урагш ба урвуу) байх ёстой бөгөөд тэдгээр нь өндөр температурт тэсвэртэй байх ёстой. Праймерууд нь зорилтот ДНХ-ийн фрагментийн төгсгөлд нэмэлт, нэг судалтай богино ДНХ-ийн дараалал юм. ПГУ-д синтетик праймеруудыг ашигладаг. Праймерууд нь дээжийн ДНХ-ийн нэмэлт суурьтай холбогдож, шинэ хэлхээний нийлэгжилтийг эхлүүлдэг. Энэ үе шатыг Taq полимераза гэж нэрлэгддэг ферментээр катализ болгодог; Thermus auqaticus-аас тусгаарлагдсан термостат ДНХ полимеразын фермент. Праймер ба нуклеотид (барилгын материал) байгаа үед Так полимераз нь ДНХ-ийн загварт нэмэлт ДНХ-ийн шинэ хэлхээ үүсгэдэг. ПГУ-ын хөтөлбөрийн төгсгөлд гель электрофорез ашиглан олшруулсан ДНХ-ийн фрагмент ажиглагдаж байна. Хэрэв нэмэлт шинжилгээ шаардлагатай бол ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг гельээс цэвэршүүлнэ.
ПГУ нь удамшлын болон олдмол өвчнийг оношлох, хянах, гэмт хэрэгтнүүдийг илрүүлэх (шүүхийн шинжилгээний чиглэлээр), ДНХ-ийн зорилтот сегментийн бүтэц, үйл ажиллагааг судлах, организмын геномын дараалал, зураглал хийх, гэх мэт. ПГУ нь олон төрлийн хэрэглээтэй тул эрдэмтдийн дунд анагаах ухаан, молекул биологийн судалгааны лабораторид ердийн лабораторийн арга болжээ.
Зураг_2: Полимеразын гинжин урвал
Ген клонжуулалт ба ПГУ-ын ялгаа нь юу вэ?
Ген клонинг ба ПГУ |
|
| Ген клончлол гэдэг нь рекомбинант ДНХ-ээр дамжуулан in vivo тодорхой генийн олон хуулбарыг хийж, эзэн нян болгон хувиргах үйл явц юм. | ПГУ-ын техник нь ДНХ-ийн тодорхой дарааллын олон хуулбарыг ПГУ-ын урвалын давталтын циклээр in vitro-д гаргадаг. |
| Рекомбинант ДНХ-г бүтээх шаардлага | |
| Генийн байршлыг тогтоохын тулд рекомбинант ДНХ үүсдэг. | Рекомбинант ДНХ үүсдэггүй. |
| Хөдөлмөрийн хэрэгцээ | |
| Энэ процесс нь хөдөлмөр их шаарддаг. | Эрчимтгий хөдөлмөр хийх шаардлагагүй. |
| In vivo эсвэл In vitro процесс | |
| Рекомбинант ДНХ-ийн бүтээц нь in vitro, ДНХ-ийн олшруулалт нь in vivo. | ДНХ-ийн олшруулалт нь in vitro бүрэн явагддаг. |
Хураангуй – Ген хувилах vs ПГУ
Генийн клонжуулалт ба ПГУ-ын ДНХ-г олшруулахад ашигладаг хоёр арга юм. ПГУ нь рекомбинант ДНХ болон эзэн организмыг ашиглахгүйгээр тодорхой ДНХ-ийн фрагментийн ДНХ-ийн олон хуулбарыг хийдэг in vitro процесс юм. Ген хуваах нь үндсэндээ in vivo процесс бөгөөд рекомбинант ДНХ-ийг бүтээх замаар эзэн организмын дотор сонирхолтой генийн олон хуулбарыг бий болгодог. Энэ бол генийн клонжуулалт ба ПГУ-ын ялгаа юм.
