Үндсэн ялгаа – RT PCR ба QPCR
Полимеразын гинжин урвал нь ДНХ-ийн тодорхой хэсгийг in vitro-д өсгөхөд ашигладаг арга юм. 1983 онд Кари Муллис энэхүү техникийг зохион бүтээснээр эрдэмтэд судалгааны зорилгоор ДНХ-ийн тодорхой хэсгүүдийг мянгаас сая сая хувь болгох боломжтой болсон. Одоогийн байдлаар энэ нь олон төрлийн хэрэглээнд зориулагдсан эмнэлзүйн болон судалгааны лабораторид нийтлэг бөгөөд тогтмол хийгддэг техник болжээ. RT ПГУ, үүрлэсэн ПГУ, мультиплекс ПГУ, Q ПГУ, RT – QPCR гэх мэт уламжлалт ПГУ-ын аргын хувилбарууд байдаг. RT ПГУ ба Q ПГУ нь ПГУ-ын хоёр чухал хувилбар юм. RT ПГУ ба Q ПГУ-ын гол ялгаа нь RT ПГУ-ыг РНХ-ээс нэмэлт ДНХ (cDNA) транскрипт үүсгэх замаар генийн илэрхийлэлийг илрүүлэхэд ашигладаг бол Q ПГУ-ыг флюресцент будагч бодис ашиглан ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг бодит цагийн тоон байдлаар хэмжихэд ашигладаг.
RT PCR гэж юу вэ?
Урвуу транскрипцийн полимеразын гинжин урвал (RT ПГУ) нь РНХ-ийн илэрхийлэлийг илрүүлэхэд ашигладаг ПГУ-ын хувилбар юм. Энэ нь эд эс дэх мРНХ-ийн илэрхийлэлийг илрүүлэх маш чухал арга юм. Дээжний анхдагч материал нь РНХ байх үед RT ПГУ-ыг ашигладаг. RT ПГУ-д загвар мРНХ нь эхлээд нэмэлт ДНХ болж хувирдаг. Энэ үе шатыг урвуу транскриптаза ферментээр идэвхжүүлдэг бөгөөд энэ процессыг урвуу транскрипц гэж нэрлэдэг. Хоёрдугаарт, олшруулах зорилгоор шинээр нийлэгжсэн cDNA-д уламжлалт ПГУ-г ашигладаг.
RT ПГУ нь маш мэдрэмтгий арга бөгөөд харьцангуй бага хэмжээний РНХ дээж шаарддаг. RT ПГУ-ыг РНХ-ийн төрөл зүйл, ялангуяа хүний дархлал хомсдолын вирус, элэгний С вирус зэрэг РНХ вирүсийг оношлох, тоон тогтооход өргөн ашигладаг.
Зураг 01: RT ПГУ-ын техник
QPCR гэж юу вэ?
Тоон ПГУ (QPCR) нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг тоон байдлаар хэмжихэд ашигладаг ПГУ-ын хувилбар юм. Бодит цагийн ПГУ-ын машин ашиглан бодит цагийн олшруулалтыг хэмждэг тул үүнийг бодит цагийн полимеразын гинжин урвал гэж нэрлэдэг. Энэ нь дээжинд байгаа зорилтот дараалал эсвэл генийн хэмжээг тодорхойлох тохиромжтой арга юм. QPCR-ийн сонирхолтой онцлог нь олшруулагч болон бодит тоон үзүүлэлтийг хоёуланг нь нэг алхам болгон нэгтгэдэгт оршино. Тиймээс илрүүлэхэд гель электрофорез хийх хэрэгцээг QPCR техникээр арилгаж болно. QPCR нь ПГУ-ын урвалын явцад ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг шошголохын тулд флюресцент будагч бодис ашигладаг бөгөөд энэ нь эцсийн дүндээ шууд тоон үзүүлэлтэд хүргэдэг. ПГУ-ын бүтээгдэхүүн хуримтлагдах үед флюресцент дохионууд хуримтлагддаг бөгөөд үүнийг бодит цагийн машинаар хэмжих болно. QPCR-ийг RT ПГУ-тай хослуулж болно. Үүнийг RT - QPCR эсвэл QRT - ПГУ гэж нэрлэдэг бөгөөд эс эсвэл эдэд РНХ-ийн түвшинг илрүүлэх хамгийн хүчирхэг, мэдрэмтгий, тоон арга гэж тооцогддог.
SYBR Green болон Taqman нь бодит цагийн ПГУ-ын олшруулах процессыг илрүүлэх эсвэл үзэх хоёр арга юм. SYBR Green аргыг SYBR ногоон гэж нэрлэгддэг флюресцент будагч бодис ашиглан хийдэг бөгөөд давхар судалтай ДНХ үүсгэхийн тулд будгийг холбох замаар олшруулалтыг илрүүлдэг. Такман нь давхар шошготой датчик ашиглан хийгддэг бөгөөд 02-р зурагт үзүүлсэн шиг датчикийг Taq полимеразаар задалж, флюорофор ялгаруулах замаар олшруулалтыг илрүүлдэг. Аль аль арга нь олшруулах үйл явцын явцыг хянаж, бүтээгдэхүүний хэмжээг бодит цаг хугацаанд мэдээлдэг..
Бодит цагийн ПГУ нь генийн илэрхийлэлийг тодорхойлох, микроРНХ ба кодчилдоггүй РНХ-ийн шинжилгээ, SNP генотип, хуулбарын дугаарын хувилбаруудыг илрүүлэх, ховор мутац илрүүлэх, генийн өөрчлөлттэй организм илрүүлэх, халдвар үүсгэгчийг илрүүлэх зэрэг өргөн хүрээний хэрэглээтэй. гэх мэт
Зураг 02: ПГУ-ын тоон техник
RT ПГУ ба QPCR хоёрын ялгаа юу вэ?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT ПГУ нь олшруулалтаар генийн илэрхийлэлийг илрүүлэхэд ашигладаг техник юм. | QPCR нь ДНХ-ийг олшруулж, ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээг бодит цаг хугацаанд нь гаргадаг техник юм. |
| Урвуу транскриптаза ферментийн оролцоо | |
| Урвуу транскриптаза ферментийг RT ПГУ-д ашигладаг. | Урвуу транскриптаза ферментийг QPCR-д ашигладаггүй. |
| Флюресцентээр шошготой молекулуудын хэрэглээ | |
| Флюресцентээр шошготой будагч бодис эсвэл мэдрэгчийг RT ПГУ-д ашигладаггүй. | Флюресцентээр шошготой будагч бодис эсвэл мэдрэгчийг QPCR-д ашигладаг. |
| ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоон үзүүлэлт | |
| QPCR-тэй нийлээгүй тохиолдолд RT ПГУ нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоо хэмжээг тодорхойлохгүй. | QPCR ПГУ-ын бүтээгдэхүүний тоон хэмжилт. |
| Эхлэх материал | |
| Эхлэх материал нь мРНХ. | Эхлэх материал нь ДНХ. |
| CDNA-ийн синтез | |
| Нэмэлт ДНХ RT ПГУ-ын үед үүсдэг. | QPCR-ийн үед нэмэлт ДНХ үүсдэггүй. |
Хураангуй – RT ПГУ ба QPCR
RT ПГУ ба QPCR нь уламжлалт ПГУ-ын хоёр хувилбар юм. RT ПГУ-ын техникийг мРНХ-ийн дээжинд хийдэг бөгөөд энэ нь урвуу транскрипц болон cDNA-г үйлдвэрлэх замаар явагддаг. QPCR нь флюресцент будаг эсвэл шошготой датчик ашиглан бодит цагийн ПГУ-ын дулааны мөчлөгийн үед ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээг тодорхойлоход хэрэглэгддэг. QPCR-д ПГУ-ын бүтээгдэхүүний хэмжээг дээжээр ялгарах флюресцент дохиогоор илэрхийлдэг. RT ПГУ-ыг олшруулах процесс болгон ашигладаг бол QPCR нь тоон үзүүлэлт болгон ашигладаг. Энэ нь RT ПГУ болон QPCR хоёрын ялгаа юм.
