Гол ялгаа: Хойд ба Өмнөд ба Баруун Блтинг
ДНХ, РНХ болон уургийн тодорхой дарааллыг илрүүлэх нь молекул биологийн янз бүрийн төрлийн судалгаанд зайлшгүй шаардлагатай. Гель электрофорез нь ДНХ, РНХ, уураг зэргийг хэмжээгээр нь ялгах арга юм. Гель профайлаас тодорхой ДНХ-ийн дараалал, РНХ-ийн дараалал, эсвэл уураг нь шошготой датчик ашиглан хатаах, эрлийзжүүлэх тусгай техникээр илрүүлдэг. Урд, хойд, баруун гэсэн гурван өөр төрлийн арчих арга байдаг. Хойд өмнөд ба баруун хэсгийн blotting хоорондын гол ялгаа нь дээжээс илрүүлсэн молекулын төрлөөс хамаардаг. Southern blotting нь ДНХ-ийн дээжээс тодорхой ДНХ-ийн дарааллыг илрүүлэх арга юм. Northern blotting нь РНХ дээжээс тодорхой РНХ дарааллыг илрүүлэх арга юм. Western blotting нь уургийн дээжээс тодорхой уураг илрүүлэх арга юм.
Southern Blotting гэж юу вэ?
Southern blotting техникийг 1975 онд ДНХ-ийн дээжээс тодорхой ДНХ-ийн дарааллыг тодорхойлох зорилгоор E. M. Southern боловсруулсан. Энэ бол молекул биологид нэвтрүүлсэн анхны хатаах арга юм. Энэ нь ДНХ-ээс тодорхой ген, ДНХ-ийн тодорхой фрагмент гэх мэтийг илрүүлэх боломжийг олгосон. Өмнөд blotting техник нь хэд хэдэн үе шаттай байдаг. Эдгээр нь дараах байдалтай байна.
- ДНХ-г дээжээс тусгаарлаж, хязгаарлах эндонуклеазаар шингээдэг.
- Шидсэн дээжийг агароз гель электрофорезээр ялгана.
- Гель дэх ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд шүлтлэг уусмалын тусламжтайгаар нэг хэлхээ болж денатуратлагдсан.
- Нэг судалтай ДНХ нь капилляр дамжуулалтаар нитроцеллюлозын шүүлтүүр мембран руу шилждэг.
- Шилжүүлсэн ДНХ нь мембран дээр байнга тогтдог.
- Мембран дээрх тогтсон ДНХ нь шошготой датчикуудтай эрлийзжсэн.
- Холболтгүй ДНХ-г угаах замаар мембранаас угаана.
- Рентген хальсыг мембранд гаргаж, автортрадиограф бэлддэг.
Southern blotting нь молекул биологийн янз бүрийн асуудалд хэрэглэгддэг. Энэ нь RFLP зураглал, шүүх эмнэлгийн судалгаа, генийн илэрхийлэл дэх ДНХ-ийн метилизаци, генийн эмгэгийн мутацитай генийг илрүүлэх, ДНХ-ийн хурууны хээг илрүүлэх зэрэгт тустай.
Зураг 01: Өмнөд Blotting Technique
Norern Blotting гэж юу вэ?
Northern blotting нь генийн илэрхийлэлийг судлахын тулд дээжээс тодорхой РНХ дараалал эсвэл мРНХ-ийн дарааллыг илрүүлэх зорилготой арга юм. Энэ аргыг Alwine, Kemp, Stark нар 1979 онд боловсруулсан. Энэ нь хэд хэдэн үе шаттайгаар sourthern болон western blotting техникээс ялгаатай. Гэсэн хэдий ч, энэ аргыг тусгай шошготой датчик, илрүүлэлтийн тусламжтайгаар гель электрофорез, бүдгэрүүлэх, эрлийзжүүлэх замаар гүйцэтгэдэг. Northern blotting техникийг дараах байдлаар гүйцэтгэнэ.
- РНХ-г дээжээс гаргаж аваад гель электрофорезээр ялгана.
- РНХ-г гельээс цэвэрлэх мембран руу шилжүүлж, тогтооно.
- Мембраныг cDNA эсвэл RNA-аас бэлтгэсэн шошготой датчикаар эмчилдэг (зонд нь дээж дэх тодорхой дараалалд нэмэлт юм).
- Сондоныг мембрантай хамт өсгөвөрлөж, тодорхой дарааллаар холбоно.
- Холбогдсон датчикуудыг угаасан.
- Эрлийзжүүлсэн фрагментуудыг авторентографаар илрүүлдэг.
Northern blotting нь эрлийзжүүлсэн мРНХ-ийг илрүүлэх, тоон тодорхойлох, РНХ-ийн задралыг судлах, РНХ-ийн хагас задралын хугацааг үнэлэх, РНХ-ийн залгалтыг илрүүлэх, генийн илэрхийлэлийг судлах гэх мэт чухал хэрэгсэл юм.
Зураг 02: Northern Blotting
Western Blotting гэж юу вэ?
Вестерн blotting нь шошготой эсрэгбие ашиглан уургийн хольцоос тодорхой уураг илрүүлэх арга юм. Тиймээс western blot-ийг мөн иммуноблот гэж нэрлэдэг. Энэ аргыг 1979 онд Towbin нар нэвтрүүлсэн бөгөөд одоо уургийн шинжилгээнд зориулж лабораторид тогтмол хийдэг. Алхамууд дараах байдалтай байна.
- Уургийг дээжээс гаргаж авсан
- Уургийг полиакриламид гель электрофорез ашиглан хэмжээгээр нь ялгадаг
- Салгасан молекулууд нь электропорацийн аргаар PVDF мембран эсвэл нитроцеллюлозын мембран руу шилждэг
- Мембран нь эсрэгбиетэй өвөрмөц бус холбогдохын тулд блоклогдсон байна
- Шилжүүлсэн уураг нь анхдагч эсрэгбиемтэй (ферментээр тэмдэглэгдсэн эсрэгбие) холбогддог.
- Мембраныг тусгай бус холбоотой анхдагч эсрэгбиемүүдийг арилгахын тулд угаана
- Холбогдсон эсрэгбиемүүдийг субстрат нэмж, үүссэн өнгөт тунадасыг илрүүлэх замаар илрүүлдэг
Вестерн blotting нь хүний сийвэнгийн дээжээс ХДХВ-ийн эсрэгбие илрүүлэхэд тустай. Вестерн blot-ийг гепатит В-ийн халдварыг баталгаажуулах, галзуу үхрийн өвчнийг илрүүлэх эцсийн шинжилгээ болгон ашиглаж болно.
Зураг 03: Western Blotting
Умард Өмнөд болон Баруун Блотинг хоёрын ялгаа юу вэ?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Илэрсэн молекулын төрөл | |
| Northern Blotting | Northern blotting нь РНХ дээжээс тодорхой РНХ-ийн дарааллыг илрүүлдэг. |
| Southern Blotting | Southern blotting нь ДНХ-ийн дээжээс тодорхой ДНХ-ийн дарааллыг илрүүлдэг. |
| Western Blotting | Western blotting нь уургийн дээжээс тодорхой уураг илрүүлдэг. |
| Гельний төрөл | |
| Northern Blotting | Энэ нь агароз/формальдегид гель ашигладаг. |
| Southern Blotting | Энэ нь агароз гель ашигладаг. |
| Western Blotting | Энэ нь Полиакриламидын гель ашигладаг. |
| Цэвэрлэх арга | |
| Northern Blotting | Энэ бол хялгасан судасны шилжүүлэг. |
| Southern Blotting | Энэ бол хялгасан судасны шилжүүлэг. |
| Western Blotting | Энэ бол цахилгаан дамжуулалт. |
| Ашигласан датчик | |
| Northern Blotting | цДНХ эсвэл РНХ-ийн мэдрэгчийг цацраг идэвхт эсвэл цацраг идэвхт бус гэж тэмдэглэсэн. |
| Southern Blotting | ДНХ-ийн мэдрэгчийг цацраг идэвхт эсвэл цацраг идэвхтгүй гэж тэмдэглэсэн. |
| Western Blotting | Анхдагч эсрэгбиемүүдийг датчик болгон ашигладаг. |
| Илрүүлэх систем | |
| Northern Blotting | Үүнийг авторадиограф эсвэл гэрэл эсвэл өнгөний өөрчлөлтийг илрүүлэх ашиглан хийдэг. |
| Southern Blotting | Үүнийг авторадиограф, гэрэл эсвэл өнгөний өөрчлөлтийг илрүүлэх ашиглан хийдэг. |
| Western Blotting | Энэ нь гэрэл эсвэл өнгөний өөрчлөлтийг илрүүлэх ашиглан хийгддэг. |
Хураангуй – Хойд ба Өмнөд ба Баруун Блтинг
Blotting нь дээжээс тодорхой ДНХ, РНХ эсвэл уураг тодорхойлоход зориулагдсан тусгай арга юм. Тодорхой төрлийн молекулыг илрүүлэхийн тулд хойд, өмнөд, баруун гэсэн гурван тусдаа арга байдаг. Northern blotting техник нь РНХ-ийн холимогоос тодорхой РНХ-ийн дарааллыг илрүүлэх зорилготой. Southern blotting техник нь ДНХ-ийн дээжээс тодорхой ДНХ-ийн дарааллыг илрүүлэх боломжийг олгодог бөгөөд уургийн хольцоос тодорхой уураг ялгахын тулд western blotting техникийг боловсруулсан.
