Голден Гейт болон Гибсон Ассемблей хоёрын гол ялгаа нь Голден Гейт нь клончлох тодорхой дарааллын дотор хязгаарлалтын сайтууд байгаа эсэхэд тулгуурладаг бол Гибсон Ассемблэй нь тодорхой дарааллын дотор хязгаарлалтын сайтууд байгаа эсэхэд найддаггүй. хувилах.
Сүүлийн арван жилийн хугацаанд молекулын эрдэмтэд олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон хялбархан нэгтгэх боломжийг олгодог янз бүрийн стандартчилагдсан процедурыг боловсруулсан. Иймээс Хязгаарлалтын ферментийн холболт, гарцын клонжуулалт, Гибсоны ассемблей, Алтан хаалганы угсралт, ТОПО клонжуулалт зэрэг клончлох аргуудыг судлаачид шинжлэх ухааны туршилтанд өргөнөөр ашигладаг. Тиймээс Голден Гейт болон Гибсон Ассемблей нь олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон нэгтгэх боломжийг олгодог молекул клончлох хоёр арга юм.
Алтан хаалганы чуулган гэж юу вэ?
Golden Gate нь олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон угсрах боломжийг олгодог молекул клонжуулах арга юм. Энэ арга нь клончлох тодорхой дарааллаар хязгаарлах сайтууд байгаа эсэхэд тулгуурладаг. Энэ нь 1996 онд үүссэн. Энэ техник нь IIS төрлийн хязгаарлалтын ферментүүд болон T4 ДНХ лигазыг ашигладаг. Эдгээр ферментүүд ДНХ-г таних талбайн гадна зүсдэг. Тэд палиндром бус хэт гажиг үүсгэж болно. Тиймээс ДНХ-ийн олон фрагментийг хэт давхцах дарааллын хослолыг ашиглан угсарч болно.
Зураг 01: Алтан хаалга
Алтан хаалганы чуулганы журам
Голден Хаалга техник нь процедурын үндсэн гурван үе шаттай:
- клончлох вектор дотор хэт гажиг үүсгэх,
- хэтэрхий хэсгүүдэд фрагментийн тусгай дарааллыг ашиглан олон ДНХ оруулга угсрах ба
- ligation.
Golden Gate угсралт нь дугуй клончлох векторуудыг (очих вектор) ашигладаг. Цаашилбал, энэ аргын хувьд задаргаа болон холбогчийг нэгэн зэрэг гүйцэтгэхийн тулд хязгаарлалтын талбайг холбосон бүтээгдэхүүнээс арилгадаг. Алтан хаалганы дулааны мөчлөгийн ердийн протокол нь 37 °C-аас 16 °C-ийн хооронд хэлбэлздэг, учир нь хязгаарлах ферментийн хувьд 37 °C, лигазын хувьд 16 °C нь оновчтой байдаг.
Гибсоны чуулган гэж юу вэ?
Gibson Assembly нь олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон цуглуулах боломжийг олгодог молекул клончлох арга юм. Алтан хаалганы аргаас ялгаатай нь энэ арга нь клончлох тодорхой дарааллаар хязгаарлах сайтууд байгаа эсэхээс хамаардаггүй. Үүнийг Ж. Крэйг Вентерийн хүрээлэнгийн Даниел Гибсон олсон. Энэ техник нь нэг төрлийн дараалал ба лигазаас хамааралгүй клончлох (SLIC) арга юм.
Зураг 02: Гибсоны чуулган
Гибсоны чуулганы журам
Гибсоны ассемблейд зэргэлдээх ДНХ-ийн хэсгүүдтэй давхцаж буй 20-40 хос суурь агуулсан ДНХ-ийн хэлтэрхий хэрэгтэй. ПГУ-ын тусламжтайгаар давхцлыг нэмдэг. Дараа нь эдгээр ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд нь гурван ферменттэй Гибсон мазерын холимогт нэмэгддэг. Энэ процедурыг изотермийн нөхцөлд (1 цагийн турш 50 ° C) гурван өөр ферментийг ашиглан гүйцэтгэдэг: экзонуклеаза, ДНХ полимераза, ДНХ лигаз. Экзонуклеаз нь ДНХ-ийг 5' төгсгөлөөс зажилдаг. Тиймээс энэ нь полимеразын үйл ажиллагааг саатуулдаггүй бөгөөд нэг процессоор урвал явагдах боломжийг олгодог. Зэргэлдээх ДНХ-ийн хэлтэрхийнүүд дээр үүссэн нэг судалтай бүсүүд нь давхцсан дарааллын улмаас эвдэрч болно. ДНХ полимераз нь нуклеотид нэмж хийснээр цоорхойг дүүргэдэг. Эцэст нь ДНХ-ийн лигаза нь зэргэлдээх сегментүүдийн ДНХ-тэй ковалент байдлаар холбогддог. Ер нь Gibson Assembly нь шугаман чиглэлийн векторуудыг ашигладаг. Түүнчлэн, энэ арга нь дарааллын ижил төстэй байдалд үндэслэн 15 хүртэлх ДНХ-ийн фрагментийг нэгэн зэрэг нэгтгэх боломжтой.
Голден Гейт болон Гибсон Ассемблей хоёрын ижил төстэй байдал
- Golden Gate болон Gibson Assembly нь молекул клонжуулах хоёр арга юм.
- Хоёр арга нь олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон нэгтгэж чадна.
- Эдгээр аргууд нь очих векторуудыг ашигладаг.
- Хоёр арга нь ДНХ-ийн олон фрагментийг угсрахдаа дулааны циклийг ашигладаг.
- Тэдгээрийг сайт руу чиглэсэн мутагенезид ашигладаг.
Голден Гейт болон Гибсон Ассемблей хоёрын ялгаа
Golden Gate нь клончлох тодорхой дарааллаар хязгаарлах цэг байгаа эсэхэд тулгуурлан олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон нэгтгэхэд ашигладаг молекул клончлох арга бол Гибсон Ассемблей нь молекул клончлох арга юм. Клончлох тодорхой дарааллаар хязгаарлах цэгүүд байгаа эсэхэд найдахгүйгээр олон ДНХ-ийн хэлтэрхийг нэг хэсэг болгон цуглуулах. Энэ бол Алтан хаалга ба Гибсон Ассемблей хоёрын гол ялгаа юм. Цаашилбал, Golden Gate арга нь дугуй чиглэлийн векторыг ашигладаг бол Gibson Assembly арга нь шугаман чиглэлийн векторыг ашигладаг.
Дараах инфографик нь Голден Гейт болон Гибсон Ассемблей хоёрын ялгааг харуулсан болно.
Товч мэдээлэл – Алтан хаалга ба Гибсоны чуулган
Молекулын клонжуулалт нь рекомбинант ДНХ молекулуудыг нэгтгэж, тэдгээрийн репликацийг эзэн организм дотор чиглүүлэхэд ашигладаг арга юм. Golden Gate болон Gibson Assembly нь ДНХ-ийн олон фрагментийг нэг хэсэг болгон нэгтгэх боломжийг олгодог молекул клонжуулах хоёр арга юм. Алтан хаалганы арга нь клончлох тодорхой дарааллын дотор хязгаарлалтын сайтууд байгаа эсэхэд тулгуурладаг бол Гибсон Ассемблэй нь клончлох тодорхой дарааллын дотор хязгаарлалтын сайтууд байгаа эсэхээс хамаардаггүй. Тиймээс энэ бол Алтан хаалга болон Гибсон Ассемблей хоёрын гол ялгаа юм.
